Рецепторные тирозинкиназы

Доменная организация ферментов

В отсутствие лиганда Рц фермент находится в неактивном состоянии из-за формирования внутримолекулярной связи фосфорилированного С-конца молекулы (Y(P)529) с SH2 доменом. Фосфорилирование Src в данном положении катализирует Src-киназа (CSK — С-Src kinase). Механизм активации Src включает либо дефосфорилирование Y529, либо многостадийный процесс, включающий изменение конформации фермента и аутофосфорилирование киназного домена по Y419, что стабилизирует активную конформацию белка. Такая конформационная перестройка может стимулироваться прямо активированным Рц или опосредованно — через адапторные белки (например, She). Вирусный аналог src вируса саркомы Рауса (v-src), опосредующий трансформацию клеток, не содержит на С-конце тирозин, соответственно не формирует внутримолекулярной связи и поэтому конститутивно активен. Субстратами киназ семейства Src служат многие белки, в частности белки, связанные с функциями цитоскелета и подвижностью клеток (например, линкер между цитоскелетом и мембраной эзрин, Са2+-АТФаза, актинсвязывающий белок кортактин).

PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы) катализируют фосфорилирование инозитольного кольца в составе фосфатидилинозитидов. Известно несколько групп ферментов, различающихся по субстратной специфичности и регуляции. Рассматриваемые здесь PI3K относятся к классу I, предпочтительно катализируют фосфорилирование фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата и состоят из регуляторной (85 кДа) и каталитической (ПО кДа) СЕ. Регуляторная СЕ выполняет несколько функций. Во-первых, без неё каталитическая СЕ не активна. Во-вторых, р85 служит адаптером для регуляции ферментативной активности рПО. В третьих, р85 служит местом посадки для ряда других элементов проведения сигнала. Первый SH2 домен р85 (а также каталитическая СЕ) участвует в опосредовании регуляторного действия р/у-СЕ G-белков на активность РІЗК.

Продукт каталитической активности

Второй SH2 домен р85 способен взаимодействовать со вспомогательным белком Nef вируса иммунодефицита человека, что обеспечивает активацию ассоциированной с Nef киназы РАК (р21-activated kinase — киназа, активируемая р21) и последующую виремию. С этим же доменом способен взаимодействовать регулируемый фосфорилированием ассоциированный с Grb2 белок Gabl (GRB — growth factor receptor-bound protein — белок, связанный с Рц факторов роста), который также повышает активность PI3K. С Ras-GAP доменом р85 взаимодействует родственный Ras-GAP белок, Rho-GAP, который за счёт ускорения гидролиза ГТФ инактивирует родственные Ras белки Rho, Rac и Cdc42.

СЕ рПО PI3K может служить объектом не только опосредованной р85, но и прямой регуляции (в частности, путём взаимодействия с Ras). Кроме того, регуляция активности фермента может осуществляться путём аутофосфорилирования.

Продукт каталитической активности PI3K — Р1-3,4,5-Р3 — регулирует активность многих белков, содержащих РН домен (таких как протеинкиназы РКВ(=АКТ) и Btk, PLCy2, Grb). В результате конечные эффекты действия PI3K очень разнообразны и включают митогенез, регуляцию апоптоза, хемотаксис и движение клеток, многие обменные процессы (в том числе проницаемость клеточной мембраны для глюкозы и синтез гликогена).

PTPs. Протеинтирозинфосфатазы (PTPs) подкласса ферментов, содержащих SH2 домены, участвуют в проведении сигнала двумя способами: путём дефосфорилирования белков и путём функционирования в качестве адаптеров для взаимодействия с Рц других элементов системы проведения сигнала. Ферментативная активность РТР повышается в результате фосфорилирования Рц. Это фосфорилирование, кроме того, создаёт сайты связывания для других элементов системы проведения сигнала (в частности, адаптера Grb2).

Ферментативная активность РТР

Ферментативная активность РТР регулируется также путём изменения конформации белка при его связывании с фосфорилированным Рц. N-концевой SH2 домен фермента в неактивной конформации связан с каталитическим доменом, что блокирует его активность. Связывание N-концевого SH2 домена фермента с фосфорилированным Рц приводит к разрушению указанного внутримолекулярного взаимодействия, что снимает блок с каталитического домена. Второй SH2 домен РТР также принимает участие в связывании с Рц, обеспечивая прочность и специфичность этого связывания. Мутации гена этого фермента являются причиной ряда тяжёлых заболеваний, таких как синдром Нунан (1 на 1000-2500 новорождённых) и синдром LEOPARD (multiple lentigines, electrocardiographic conduction abnormalities, ocular hypertelorism, pulmonic stenosis, abnormal genitalia, retardation of growth, and sensorineural deafness). Полагают, что мутации при синдроме Нунан, затрагивающие N-концевой SH2 домен, смещают равновесие между ферментативно неактивной и активной формами Рц в сторону последней. Субстратами Рц-тирозинкиназ могут быть протеинфосфатазы и других типов, не содержащие SH2 доменов (например, РТР1В).

GEFs. Важным элементом системы проведения сигналов ряда классов Рц, включая Рц-тирозинкиназы, являются факторы, ускоряющие обмен ГДФ на ГТФ (GEFs) в малых G-белках типа Ras и Rho. Такой обмен ведёт к активации указанных белков. Одним из GEFs является белок Sos (son of sevenless; имеется в виду, что активность этого фактора регулируется Рц, отличными от сопряжённых с G-белками Рц, содержащих 7 трансмембранных доменов).

В неактивном белке домен Н2А (область гомологии с гистоном Н2А) формирует внутримолекулярную связь с доменом РН (областью гомологии с плекстрином), что блокирует активность белка.

Взаимодействие Sos с С-концевым SH3

Взаимодействие Sos с С-концевым SH3 доменом адаптера Grb2 происходит с участием богатого пролином фрагмента С-концевой области Sos. Сайт взаимодействия с Ras включает область на границе доменов RhoGEF и РН. Известен ряд других белков данного семейства, имеющих сходную организацию, но различающихся ре-гуляторными элементами. На рис. 5.29Б показана доменная организация фактора PDZGEF1, управляемого Рц, сопряжёнными с G-белками. Данный GEF посредством домена PDZ прямо взаимодействует с р-АдРц и активирует Ras зависимым от цАМФ образом. цАМФ связывается с доменом CNMP. Связывание с Ras осуществляется с участием домена RasBD. Интересно, что активация гомолога Ras Rapl под действием PDZGEF1 происходит независимо от цАМФ.

Ras. Активация Ras или его гомологов ведёт к стимуляции взаимодействующих с ними серин/треонинпротеинкиназ типа Rafl, которые являются первыми членами каскадов протеинкиназ, конечные члены которых (в частности, MAPKs — активируемые митогенами протеинкиназы) способны фосфорилировать разные субстраты (в частности, транскрипционные факторы, определяющие долгосрочные эффекты сигнальных соединений на экспрессию контролируемых генов). Известно несколько десятков гомологов Ras, мутации которых (в частности, блокирующие ГТФазную активность) превращают эти регуляторные белки в онкогены.

Клонировано 2 гомологичных Рц (PDGFRa и PDGFRP), способных к гомо- и гетеродимеризации. PDGFRa связывает все три возможные формы PDGF (АА, АВ и ВВ), PDGFRP проявляет предпочтение ВВ >АВ »АА. Гетеродимеры PDGFRa/PDGFRp связывают формы АВ и ВВ. Связывание лигандов стимулирует не только активацию Рц, но и их десенситизацию путём интернализации (в PDGFRp-зависимой от фосфотирозила-579) и деградации (зависимой от фосфотирозилов 1009 и 1021). Деградация Рц связана с ко-валентным присоединением многих копий убиквитина и транспортировкой в протеасомы.