Модели активации рецепторов

В соответствии с моделью «двух состояний», Рц находится в равновесном состоянии между неактивной конформацией (R) и активной конформацией (R*). В отсутствие агониста преобладает неактивное состояние, но энергетический барьер между двумя состояниями небольшой, что обеспечивает возможность нахождения небольшой части популяции рецепторных молекул в состоянии R*. Предполагается, что агонисты с наибольшим сродством связываются с Рц в конформации R* и смещают равновесие в сторону R*. Обратные, или негативные, антагонисты (т.е. лиганды, тормозящие конститутивную активность Рц) предположительно должны стабилизировать неактивную конформацию R, сдвигая равновесие в её сторону. Нейтральные антагонисты одинаково хорошо связываются с R и R* и не смещают равновесие. Не все экспериментальные данные могут быть удовлетворительно интерпретированы в рамках данной модели.

Накапливаются данные, свидетельствующие о том, что Рц может находиться во множестве конформационных состояний. Например, некоторые мутации Рц D2 дофамина способны блокировать действие одних агонистов и не влияют на действие других. В соответствии с одной из моделей «множественных состояний» биологический эффект данного лиганда определяется конформацией Рц, к которой у этого лиганда имеется наибольшее сродство. Эта конформация стабилизируется лигандом и, соответственно, становится преобладающей. Для данной модели не имеет значения, совпадают ли участки связывания разных лигандов. Лимитирующим этапом активации Рц, по-видимому, является конформационный переход, а не связывание агониста. Предполагается, что этот конформационный переход происходит через несколько промежуточных стадий, включающих последовательную стабилизацию отдельных доменов Рц с установлением дополнительных контактов Рц с лигандом. Возможно, активную конформацию Рц дополнительно стабилизирует G-белок, что должно вести к снижению энергетического барьера и ускорению конформационного перехода Рц.

Пути проведения сигналов

GPCRs (Рц, сопряжённые с G-белками) влияют на функции клетки преимущественно через ассоциированные с ними гетеро-тримерные G-белки, построенные из СЕ а, (3 и у. Известно несколько типов каждой из СЕ. Направленность действия G-белка определяется прежде всего типом сх-СЕ (s, і, о, q, всего известно 17 типов), который и дает название всему G-белку (Gs, GP Go, GJ. a-CE способна связывать гуанидиновые нуклеотиды (ГТФ и ГДФ) и обладает ГТФазной активностью (давшей название «G» данному семейству белков). В неактивированном состоянии G-белка с а-СЕ связан ГДФ. В результате активации Рц G-белка сродство а-СЕ к ГДФ снижается, а сродство к ГТФ возрастает, что приводит к замене ГДФ на ГТФ в комплексе с а-СЕ. Параллельно происходит диссоциация G-белка на а- и ру-СЕ, каждая из которых имеет собственные объекты действия (рис. 5.15). Функциональное значение ГТФазной активности а-СЕ заключается в ограничении во времени действия проводимого сигнала: превращение ГТФ в ГДФ стимулирует реассоциацию а- и Ру-СЕ в неактивный тримерный G-белок.

Как правило, биологические эффекты агониста, опосредуемые GPCR, реализуются параллельно через несколько взаимодействующих между собой путей проведения сигнала.

Каскад МАРК

Активируемые митогенами протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) фосфорилируют белковые субстраты по остаткам серина и треонина в консенсусних последовательностях, содержащих пролин. Среди субстратов МАРК находятся и транскрипционные факторы. Активация MAPKs осуществляется их фосфорилированием киназами МАРК — МАРКК (в частности, МЕК). В свою очередь, активация МАРКК достигается их фосфорилированием киназами МАРКК — МАРККК (в частности, Rafl), а также некоторыми другими киназами (например, протеинкиназой С — РКС).

Действие на JNK и другие родственные МАРК белки

Активация МАРККК происходит при их взаимодействии с малыми G-белками (ГТФазами) семейства Ras, активируемыми при замене связанного ГДФ на ГТФ. Эта замена облегчается рядом белковых факторов, включая Sos (son of sevenless — белок, активируемый Рц, не содержащими 7 трансмембранных доменов), Ras-GRF (Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor — специфичный в отношении белка Ras гуаниннуклеотид-рилизинг фактор), ЕРАС (exchange factor directly activated by cAMP — обменивающий фактор, прямо активируемый цАМФ) и затрудняется фактором Rap-GAPII (Rap-GTPase activating protein — белок, активирующий ГТФазу Rap). Регуляция активности этих факторов Ру-СЕ GPCRs может происходить через активацию рецепторных (RTKs) и нерецепторных тирозинкиназ (например, семейства Src). Активация RTKs приводит к созданию сайтов связывания белковых комплексов, включающих Sos, который в свою очередь активирует Ras. Активация фосфатидилинозитид-3-киназы PI3K происходит при прямом взаимодействии с GPy-CE. Родственный Ras белок Rapl может действовать на МАРК тканеспецифично, стимулируя или тормозя её активность. Активность Rapl реципрокно контролируется Get и Gas. Разнообразие путей действия GPCRs на МАРК создаёт основу для тканеспецифичности ответов на данный сигнал.

N-концевая киназа Jun (Jun N-terminal kinase, JNK) структурно сходна с МАРК. Аналоги Ras в каскадах активации JNK — Rac и Cdc42. Активировать Racl и Cdc42 могут Gpy-CE, а также Ga12 и Ga13. В качестве факторов, сопрягающих G-белки с Rac/Cdc, по-видимому, выступают факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs) Tiaml и Dbl [аналоги Ras-GRF (Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor — специфичный в отношении белка Ras гуаниннуклеотид-рилизинг-фактор) 1 и 2], взаимодействующие с Rac посредством домена гомологии Dbl (DH-домена). Промежуточными факторами могут быть адапторные белки Crk или паксиллин, рекрутируемые PYK2 (proline-rich tyrosine kinase — богатая пролином тирозинкиназа 2) и FAK (киназа точечной адгезии, focal adhesion kinase). Goc12 способна активировать JNK также в обход Rac/Cdc, действуя через одну из киназ МЕКК — ASK1.

Нерецепторные тирозинкиназы

Семейство р38 MAPKs включает 4 члена (р38а, р38р, ERK6 (extracellular signal-regulated kinase 6 — киназу 6, регулируемую внеклеточными сигналами) и SAPK4 (stress-activated protein kinase — протеинкиназа, активируемая стрессом). Механизмы их активации

G-белками включают нерецепторные тирозинкиназы Btk и Src. Большая активируемая митогенами киназа ERK5 участвует в регуляции экспрессии генов (в частности, за счёт фосфорилирования транскрипционного фактора MEF2 — myocyte enhancer factor — энхансерный фактор миоцитов).

Регуляция ионных каналов G-белками

Все ионные каналы имеют общую структурную особенность: наличие поры, образуемой трансмембранными сегментами белка. Конформация белка динамически изменяется между открытым и закрытым состоянием поры. Большинство ионных каналов регулируется нейромедиаторами и гормонами через Рц, сопряжённые с G-белками опосредованно (через вторые посредники) или прямо. Прямое взаимодействие G-белков с ионными каналами показано для активируемых G-белками К+-каналов входящего выпрямления

(GIPvKs) и для некоторых потенциалзависимых Са2+ каналов (voltage-activated Са2+ channels, Са2+у).

GIRKs опосредуют постсинаптическое ингибиторное действие ряда нейромедиаторов (дофамин, соматостатин, опиоиды и др.) в нейронах и в значительной мере определяют хронотропное парасимпатическое действие на сердце. Эффект опосредуется ру-СЕ G-белков (GPy). Показано, что в каждой СЕ GIRK имеется по 3 Gpy-связывающих сегмента (рис. 5.18А, утолщенные сегменты внутриклеточных N- и С-концов), в результате на канал приходится до 12 таких сегментов, обеспечивающих связывание 4 димеров Ру тет-рамерным GIRK (тетрамерные GIRKs состоят из 4 типов СЕ, GIRK1—4. Функциональными каналами могут быть гомотетрамеры GIRK2 и GIRK4 или гетеротетрамеры GIRK1/2, GIRK1/3, GIRK2/3 и GIRK1/4. Основой структуры каналов служат трансмембранные а-спирали Ml и М2, а также возвратная спиральная Р-петля, служащие избирательным фильтром для ионов.) Способностью активировать GIRK обладают все исследованные комбинации G(3 и Gy. В то же время в нейронах и сердце только чувствительные к коклюшному токсину G-белки (т.е. содержащие Gai/o) активируют GIRK.

Сужение цитоплазматического выхода

Полагают, что роль Ga заключается в направленной доставке G(3y: гетеротримерный Gocpy с участием Ga взаимодействует с N-концом GIRK и после активации Рц агонистом отделившийся гетеродимер GPy взаимодействует с находящимися по соседству сегментами GIRK. Полагают также, что связывание GPy приводит к изменениям конформации спирали М2 и проксимальной части С-конца GIRK, которые определяют расширение или сужение цитоплазматического выхода поры. Кроме того, меняется проницаемость или открытость поры в районе Р-петли.

Потенциалзависимые каналы Cav состоят из формирующей пору СЕ а, и по меньшей мере двух вспомогательных СЕ (а28 и р). Пора формируется 4 гомологичными мембранными доменами, каждый из которых состоит из 6 трансмембранных ос-спи-ральных сегментов. Сегменты S4 несут положительный заряд и служат сенсорами потенциала клетки. Их перемещение в зависимости от величины потенциала приводит к открытию или закрытию поры. Нейронные каналы N- и P/Q типа, содержащие а1В и а1А СЕ соответственно, играют решающую роль в выделении нейромедиаторов. Эти каналы ингибируют многие GPCRs через независимые (VI) и зависимые (VD) от величины потенциала механизмы. VI-ингибирование может осуществляться под действием Gocq, GoCj и GPy, а также вторыми посредниками. VD-ингибирование тормозится деполяризацией и наблюдается в случаях P/Q-, N- и R-каналов, но не каналов L-типа. Действующим началом, по-видимому, являются Gpy, высвобождаемые преимущественно из Go (Gao является наиболее распространённым типом ос-СЕ G-белков в нервной системе). Участки связывания GPy в a:-CE Cav локализованы во внутриклеточной петле Lp С-концевом фрагменте и, возможно, N-koh-цевом фрагменте. Для действия Gpy на канал необходимо также присутствие р-СЕ канала. Действие Gpy усиливается белком синтаксином, который одновременно взаимодействует с петлей L2 0Cj СЕ канала и с GPy. С Сау-каналами взаимодействуют также ос-СЕ Gj и Go белков, выполняя, по-видимому, функцию доноров GPy. Ведущую роль в открытии каналов под действием высокого потенциала и их закрытии под действием GPy играет 1-й мембранный домен oCj-CE канала (в частности, трансмембранный сегмент S3).